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潔淨室品質控制及其檢測方面的討論
発表時間:2005-7-19  訪問:2829  


 

 

   

 
潔淨室對於制藥工業的重要意義已為人們肯定。生物製品 是制 藥工業的一部分,對生產廠房有很高的潔淨要求 [ 1 , 2 ] 。 Gilland 等曾在市售的 嗜酸乳桿菌產品中,分離到人為污染的短乳桿菌、發酵乳桿菌和植物乳桿菌等 [ 3 ] 。生物製品生產中,尤其是活菌、活疫苗的生產中,經常受到不同程度的污染,因此,不僅 需要重視潔淨室的建立,更要重視品質控制方法及標準。
  朝鮮戰爭中,美國發現大量電子儀器失靈,最後找到了主要原因,是灰塵在作怪,促成了潔 淨技術的起步。 1961 年,誕生了世界上最早的潔淨室標準,既美國空軍技術條令 203 , 1963 年,頒佈了國際上最著名的潔淨室標準:美國聯邦 FS209 。 1966 年,頒佈了修訂後的 209A , 時至 1992 年,建立了迄今被廣泛採用的 209E 。國際上為了加強藥品、生物製品品質管制規範 (GMP) ,把潔淨室定為必備的生產硬體之一。 GMP 對廠房、設備等,明確規定了相應的潔淨要 求,並制訂了有關標準。
1  潔淨室的污染源
  潔淨室污染源按性質可分物理、化學、生物等。直徑在 0.001-1000μm 的固態、液態或二者 的混合物質,包括生物粒子和非生物粒子,我們稱為懸浮粒子 (airborne particles) 。微生 物一般以無生命的粒子作載體而懸浮,以氣溶膠 (Aerosol) 形式存在於空氣中, 1μm 以下 者永外懸浮, 10μm 以上者會逐漸沉下來而形成菌塵。潔淨室污染可分為外部污染和內部汙 染。外部污染指大氣塵污染,可以通過光電法測得。內部污染,是由人和有關的物品、設備 等引起的。人是潔淨室最大的污染源,占 90% 左右。人和環境造成了潔淨室的污染,所以在 潔淨室中,人的數量和活動應有特別嚴格的限制。一般男性每人每分鐘向周圍排放 1000 個以 上的含菌粒子,女性為 750 個以上。穿衣服時,靜止態發菌量為 10-300 個 /min· 人,行走時 的發菌量為 900-2500 個 /min· 人。咳嗽一次發菌量為 70-700 個 /min· 人,噴嚏一次為 400-60 0 個 /min· 人 [ 4 , 5 ] 。
2  潔淨室質控標準
表 1  世界主要國家潔淨室標準 ( 潔淨度級別 )
美國
日本
西德
美國
澳大利 亞
法國
歐共體
中國
Fed Std
209
JACA
Std No24
VDI
2083
BSI
BS 5295
AS
AS 1386
AFNOR
X.44101
EEC
GMP
GB
-
1
-
-
-
-
-
-
-
2
0
-
-
-
-
-
1
3
1
C
0.035
-
-
-
10
4
2
D
0.35
-
-
-
100
5
3
E orF
3.5
4000
A/B
100
1000
6
4
GorH
35
40000
-
-
10000
7
5
J
350
400000
C
10000
100000
8
6
K
3500
4000000
D
100000
-
-
7
L
-
-
-
-
-
-
-
M
-
-
-
-
潔淨室是指空氣潔淨度達到規定級別要求的可供人類工作的場所 ,其功能是控制微粒的污染 。一般按用途可分為: 1. 工業潔淨室,以無生命的微粒為控制物件; 2. 生物潔淨室,主要 控制微生物對工作對象的污染。
  世界主要國家的潔淨室標準見表 1 [ 6 , 7 ] 。美國是世界上最早頒佈潔淨室標準的 國家,各國的潔淨室標準都是在美國標準的基礎上,結合各國的實際情況而制訂的,我國的 標準基本上參照美國聯邦標準和歐共體的標準而制訂的。
3  潔淨室質控的檢測方法及討論 8
3.1  塵埃粒子  由於空氣中存在大量塵埃粒子,而微生物大多依附於這些塵埃粒子隨空氣流動造成污染。制 藥工業用多種方法獲得無菌狀態,過濾法以其捕集率高,又經濟而被廣泛使用。其中,特別 應該提到的是採用了 HEPA(High Eqqicienoy Particulate Air) 篩檢程式,對 0.3μm 以上空氣 粒子捕集率高達 99.97% 以上,除濾過病毒外,空氣中所有微生物顆粒可被濾除。因此, 正常潔淨室是無菌的,但是,由於人、物、環境等污染因素,潔淨室往往受到不同程度 污染。因此,我們多採用鐳射塵埃粒子計數且進行監控。標準見表 2 。
表 2  國內外有關懸浮粒子的測定標準 ( 塵粒數 /m 3 )
潔淨度
  級別
中國衛生部
GMP
美 國
FS-209.
世界衛生組織及
  歐共體 GMP
≥0.5μm
≥5μm
≥0.5μm
≥5 μm
≥0.5μm
≥5μm
100
≤3500
0
3530
-
3500
-
10000
≤350000
≤2000
353000
2470
350000
2000
100000
≤3500000
≤20000
3530000
24700
3500000
2000
3.2  空氣微生物  空氣中活微生物大多依附塵埃粒子而形成生物活性粒子。應用細菌採樣器抽取一定量的空氣 使其滯留在培養基上,經過培養計數菌落數。早在現代微生物問世之前,人們就認為某些疾 病是由被稱為 “ 瘴氣 ” 的空氣污染而引起。 20 世紀 30 年代,英國研製 porton 液體採樣器,美 國研製了 AGI 液體採樣器。 1941 年, Bourdion 使用裂縫式採樣器,成為空氣微生物採樣測定 的開端。 1956 年,報導了第一個篩孔撞擊式採樣器, 1958 年 A.A.Andersn 對其加以改進並 定型生產,稱為安德森 (Anderson) 空氣微生物採樣器。它由頂罩、 6 節篩板、 3 個彈簧及抽氣 孔和動力裝置構成。目前,這種採樣器已發展到 8 級,並有許多改進型。由於它採集粒譜廣 、效率高、生物失活率低等原因而廣泛使用至今。空氣微生物採樣器一般分為七大類:液體 式、固體式、沉降式、離心式、光散射式和大容量式。本文將對離心式空氣微生物採樣器 (R CS) 作詳細討論。空氣微生物測試標準見表 3 。
表 3  國內外有關空氣微生物的測定標準 (CFU/m 3 )
潔淨度級別
美國 NASA
WHO 和歐 共體 GMP
中國衛生部 GMP
100
3.5
5
≤5
10000
17.6
100
≤100
100000
88.4
500
≤500
3.3  表面微生物  為了檢測潔淨室中牆壁、地板、儀器表面、桌 面、門把等帶菌情況,通常選用接觸壓印法 (Cortact) 和棉拭法 (Swabbing) 等方法。需要時 ,還可與過濾裝置相結合來完成棉拭採樣。 1941 年, Walter 和 Hvcker 報導了 COntact 瓊脂平 板方法,以後, Angelotti 和 Fotert 等作了進一步的工作。帶菌狀況都有要求,歐共體 GMP( 最新草案 ) 規定, 100 級:平均菌落數不可超過 5 個; 1000 級: 25 個; 100000 級: 50 個。表面微生物的檢測,越來越受到人們的重視。
3.4  關於沉降平皿 (Settle plate) 1881 年 Kock 創立。依靠空氣中的粒子自然沉降於瓊脂平板上的這種採集方法,由於粒子沉降 的速率很慢,如需採集到有效數量的粒子,就需暴露很長時間。但因空氣中的致病菌數量是 很少的,金黃色菌菌球菌在醫院病房空氣中平均每 140 升才有一個活菌粒子,為了彌補這個 缺陷,曾採用直徑為 14 公分的大平皿,以增加瓊脂的暴露面積。 Harding 和 Williams 還曾用 一種多層平板的方法來進一步暴露面積,每層放一個 14 公分直徑的平板,但結果不堪滿意。
  歐姆梁斯基曾試圖把採樣後平板上長出的菌落換算成一定體積空氣中的微生物含量,以便能 利用沉降平板法的採樣結果來測定空氣中的活菌濃度。為此,他設定了在 100cm 2 營養瓊脂 上暴露 5 分鐘後,培養長出的菌落,即相當於 10 升空氣中的活菌數。由於懸浮在空氣中的含 菌粒子直徑不超過 100μm ,這些小粒子在空氣中的沉降受空氣阻力的影響,其沉降速率遵循 國際上的 Stokes 公式。根據這個公式,粒子的沉降速率與其大小成正比,但是,歐姆梁斯基 恰好忽略了這一點,因此,它是不能成立的。例如,直徑 1μm 的含菌粒子,在 5 分鐘內沉降 距離為 1.05cm ,大部分的粒子就沉降不到瓊脂表面上。
  由於潔淨室已濾除了大部分大顆粒,一般用此法是無意義的。但是,人為、環境和潔淨裝置 故障等原因引起的較大顆粒污染以及沉降平板採樣潔的簡便,可作為日常監測潔淨室水準的 一種參考方法。
3.5  關於 RCS 9  離心式空氣採樣器 (The Reuter Centrifugal Sampler,RCS) 被介紹作為一種在醫院使用的檢 測空氣微生物的儀器,由於它輕便,無噪音而廣泛使用,並擴展到制藥工業等領域。 RCS 通 過離心收集顆粒,為制藥工業所接受,因為它似乎符合 FDA 所描述的 “Active” 採樣儀器。 。 Gre-schel 等認為它相當有效, Macher 等則持反對意見。多年來,許多研究者研究了帶菌 顆粒的大小,結論是: 5-15μm ,中等粒是 13μm ,而 4μm 以下很少。這些結果是從醫院、手 術室、辦公室、實驗室和制藥無菌室所獲得。他們認為,如果顆粒大小是已知的, RCS 可定 量測定細菌濃度,但是,目前這些顆粒大小是未知的,故不能把它視為定量採樣器,只能歸 于沉降平皿一樣的類型。 Delmore 等發現, 100 級無菌室中, RCS/slit 比率是 2.1 ,即 RCS 是 s lit 採樣器微生物捕促率的 210% 有效。我國丁璽華等也仿製了 RCS ,選用國產元件,試製了 LW C-1 型離心式空氣採樣器。
  雖然 RCS 有正反兩方面的爭議,但由於它有許多優點,並明顯優於沉降平皿, 1986 年,西方 近一半的制藥公司採用了 RCS ,作為空氣微生物採樣器,我國正在逐漸推廣。
  作者單位:姚祖華 上海生物製品研究所,上海  200052
  李亦德 上海生物製品研究所,上海  200052
參考文獻
  [ 1 ]國家醫藥管理局:藥品生產品質管制規範 ( 討論稿 ).1998.11.
  [ 2 ]孫淑濱 . 微生物學和免疫學進展, 1998 , 26(1) : 89.
  [ 3 ] Gilliland S E,et al.J Food prot.1977,40(11):760 ~ 762.
  [ 4 ]許鐘麟 . 潔淨室設計 . 第 1 版 . 地震出版社, 1994.
  [ 5 ]郁慶福 . 現代衛生微生物學 . 第 1 版 . 人民衛生出版社, 1995.
  [ 6 ] GB/T.1996,16292
  [ 7 ] Mokker a Km et al.Cleanroom Standatds & practices:worldwide.Vpdate.Clean Room Evropa proceedings,1991.
  [ 8 ] PDA.J Parenter Sci Technol 1990.(Sup),44:3 ~ 15.
  [ 9 ] Kaye S.J parenter Sci Technol 1988,42(5):147 ~ 152.

 




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